HFOB1.19人成骨細胞

細胞處理方法：
一、貼壁細胞
1、 接收到細胞，肉眼觀察細胞培養基顏色，顯微鏡觀察細胞生長情況，并對細胞進行不同倍數拍照（建議收到時的培養瓶拍一張照片，顯微鏡拍收到時的細胞 100X,200X 各一張）。
2、用 75%的酒精消毒外包裝,在超凈工作臺內打開外包裝。
3、嚴格遵循無菌操作規范，打開細胞培養瓶。
4、37度平衡1-2小時。
5、用移液管吸取培養基，到50ml離心管中，剩下細胞密度達到80%至90%可以傳代，如沒有達到添加6ml新鮮培養基繼續培養。
6、如果肉眼檢查上清有細胞，對50ml上清進行離心收集細胞，如果細胞連片狀態，棄掉上清對收集的細胞進行胰酶消化（1ml胰酶37度），接種培養。

二、懸浮細胞
1、接收到細胞，肉眼觀察細胞培養基顏色，顯微鏡觀察細胞生長情況，并對細胞進行不同倍數拍照（建議收到時的培養瓶拍一張照片，顯微鏡拍收到時的細胞 100X,200X 各一張）。
2、用 75%的酒精消毒外包裝,在超凈工作臺內打開外包裝。
3、嚴格遵循無菌操作規范，打開細胞培養瓶。
4、細胞培養瓶內的培養基用吸管*吸出（嚴禁直接傾倒）。
5、1000rpm，5min 離心，用吸管小心吸出上清，加入培養基，重懸細胞。
6、將重懸好的細胞轉入六孔板或者細胞培養瓶種，加入新鮮培養基，置于 37℃，5%CO2 培養（大部分細胞）

HFOB1.19人成骨細胞

培養步驟

一．培養基及培養凍存條件準備：

1） 準備基礎培養基( GIBCO，，添加NaHCO3 1.5g/L，丙酮酸鈉 0.11g/L)；優質胎牛血清，10%。

2） 培養條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37攝氏度，培養箱濕度為70%-80%。

3） 凍存液：90%*培養基，10%DMSO，現用現配。液氮儲存。

二． 細胞處理：

1） 復蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養瓶中培養過夜（或將細胞懸液加入10cm皿中，加入約8ml培養基，培養過夜）。第二天換液并檢查細胞密度。

2） 細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養。

對于貼壁細胞，傳代可參考以下方法：

1. 棄去培養上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。

2. 加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養瓶中，置于37℃培養箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養瓶后加少量培養基終止消化。

3. 按6-8ml/瓶補加培養基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養液后吹勻。

4. 將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養基的新皿中或者瓶中。

3）細胞凍存：待細胞生長狀態良好時，可進行細胞凍存。貼壁細胞凍存時，棄去培養基后加入少量胰酶，細胞變圓脫落后，加入約1ml含血清的培養基后加入凍存管中，再添加10%DMSO后進行凍存。

細胞注意事項：

1.收到細胞后首先觀察細胞瓶是否完好，培養液是否有漏液、渾濁等現象，若有上述現象發生請及時和我們聯系。

2.先不開瓶蓋，瓶身擦拭酒精后放在培養箱靜置數小時（4h左右），穩定細胞狀態，切忌在溫箱內靜置過夜。

3.靜置后鏡檢，拍照，記錄細胞狀態。建議傳代后也拍照記錄細胞生長情況。

4.  懸浮細胞：將細胞瓶內液體都轉移至無菌離心管內，1000 轉/分鐘離心5min，培養基上清可備用，管底細胞沉淀用培養基重懸。鏡檢時若細胞密度超過80%，可將細胞懸液分至2個細胞瓶內培養；若密度未超過80%，細胞懸液移至原瓶繼續培養，待達到80%時再正常傳代。備注：聚團生長慢，有密度依賴，必須使用T25培養瓶豎立培養，3天一次半量換液一次，1-2周傳代一次。

貼壁細胞：若細胞密度超過80%，可正常傳代；若未超過80%，收集細胞瓶內的培養基，留8ml繼續培養至80%左右再傳代，瓶蓋可稍微擰松。備注：細胞貼壁慢，傳代后細胞放2天不動。

5.細胞瓶內的培養基含血清和雙抗，可收集后4℃保存備用，可補加2%血清。剛開始傳代時建議一半用細胞瓶內的培養基，一半用客戶自備的培養基，使細胞逐漸適應培養條件，以免因不適應而造成生長狀態不佳。